Histopathological and molecular characterization of encephalitic listeriosis in small ruminants from northern Paraná, Brazil

Listeriosis is a disease primarily of ruminants caused by the Gram-positive bacterium Listeria monocytogenes. Ruminants either demonstrate manifestations of the encephalitic, septicemic, or reproductive form of listeriosis. The pathological and molecular findings with encephalitic listeriosis in a 5.5-month-old, male, mixed-breed goat and a 3-year-old Texel-crossed sheep from northern Paraná, Brazil are described. Clinically, the kid demonstrated circling, lateral protrusion of the tongue, head tilt, and convulsions; the ewe presented ataxia, motor incoordination, and lateral decumbency. Brainstem dysfunctions were diagnosed clinically and listeriosis was suspected. Necropsy performed on both animals did not reveal remarkable gross lesions; significant histopathological alterations were restricted to the brainstem (medulla oblongata; rhombencephalitis) and were characterized as meningoencephalitis that consisted of extensive mononuclear perivascular cuffings, neutrophilic and macrophagic microabscesses, and neuroparenchymal necrosis. PCR assay and direct sequencing, using genomic bacterial DNA derived from the brainstem of both animals, amplified the desired 174 base pairs length amplicon of the listeriolysin O gene of L. monocytogenes. Phylogenetic analyses demonstrated that the strains associated with rhombencephalitis during this study clustered with known strains of L. monocytogenes lineage I from diverse geographical locations and from cattle of the state of Paraná with encephalitic listeriosis. Consequently, these strains should be classified as L. monocytogenes lineage I. These results confirm the active participation of lineage I strains of L. monocytogenes in the etiopathogenesis of the brainstem dysfunctions observed during this study, probably represent the first characterization of small ruminant listeriosis by molecular techniques in Latin America, and suggest that ruminants within the state of Paraná were infected by the strains of the same lineage of L. monocytogenes.

Hepatitis E virus in liver and bile samples from slaughtered pigs of Brazil

The objective of this study was to detect and identify hepatitis E virus (HEV) strains in liver and bile samples from slaughtered pigs in the state of Paraná, Brazil. Liver and bile samples were collected from 118 asymptomatic adult pigs at a slaughterhouse in a major Brazilian pork production area. The samples were assayed using a nested reverse transcription-polymerase chain reaction protocol with primer sets targeting open reading frames (ORF)1 and 2 of the HEV genome. HEV RNA was detected in two (1.7%) liver samples and one (0.84%) bile sample using both primers sets. The HEV strains were classified as genotype 3b on the basis of their nucleotide sequences. These data suggest that healthy pigs may be a source of HEV infection for consumers of pig liver and slaughterhouse workers in Brazil.

Bovine coronavirus detection in a collection of diarrheic stool samples positive for group a bovine rotavirus

Neonatal diarrhea is an important cause of economic losses for cattle farmers. The main viral etiologies of enteric diseases are group A rotaviruses (GARV) and the bovine coronavirus (BCoV). Although both viruses infect calves of the same age, the occurrence of mixed infections is still under studied. The present study describes the co-infection of BCoV and GARV in stool samples. Forty-four diarrheic fecal samples from calves up to 60 days old that had previously tested positive for GARV by SS-PAGE were analyzed using semi-nested PCR for BCoV. A product with 251 bp of the BCoV nucleoprotein gene was amplified in 15.9 percent (7/44) of the samples, demonstrating that co-infection is not an unusual event. These results reinforce the need for testing for both GARV and BCoV, even in fecal samples that previously tested positive for one virus.

A diarreia neonatal é uma importante causa de perdas econômicas para a criação de bovinos. Os principais agentes etiológicos virais das doenças entéricas são o rotavírus bovino grupo A (GARV) e o coronavírus bovino (BCoV). Embora ambos os vírus infectem bezerros na mesma faixa etária, infecções mistas ainda são pouco estudadas. O presente trabalho descreve a identificação do BCoV em amostras de fezes positivas para o GARV, caracterizando a ocorrência de infecções mistas. Quarenta e quatro amostras de fezes diarreicas de bezerros com até 60 dias de idade, previamente identificadas como positivas para o GARV bovino por meio da técnica de SS-PAGE, foram avaliadas quanto a presença do BCoV pela técnica de semi-nested PCR. Um produto com 251 pb do gene da nucleoproteína do BCoV foi amplificado em 15,9 por cento (7/44) das amostras de fezes demonstrando que a co-infecção não é um evento raro. Esse resultado enfatizada a importância da realização simultânea do diagnóstico para esses dois importantes vírus entéricos de bezerros em surtos de diarreia neonatal tanto em rebanhos bovinos leiteiros quanto de corte.

Isolation in HRT-18 cells and molecular analysis of a BCoV strain from diarrheic feces of naturally infected calves

Bovine coronavirus (BCoV) may cause acute diarrhea in newborn calves, leading to significant economic losses for cattle farmers. There are several diagnostic techniques used to detect BCoV in calf fecal samples, but virus isolation still has advantages for antigenic and genomic characterization. This study describes the isolation in HRT-18 cells and molecular characterization of Brazilian BCoV wild-type strains. Three fecal samples from diarrheic 30 day-old calves were inoculated in HRT-18 cell monolayers, which were then evaluated for HA titers and tested using semi-nested PCR followed by RFLP and sequencing. Two samples were successfully isolated and presented HA titers of 16 and 32 units per 25 mL. The results were confirmed using semi-nested PCR and RFLP. Molecular analyses identified a cell culture-adapted strain and a wild-type strain that were genetically similar (99 percent) to each other, but more distinct than BCoV strains circulating in other countries, even in the conserved N gene.

O coronavírus bovino (BCoV) pode causar diarreia aguda em bezerros recém-nascidos, ocasionando consideráveis perdas econômicas para a pecuária bovina. Várias técnicas de diagnóstico podem ser empregadas na detecção do BCoV a partir de amostras fecais de bezerros. Porém, o isolamento do BCoV em cultivo celular apresenta a vantagem de possibilitar a caracterização antigênica e molecular da estirpe viral. O presente estudo descreve o isolamento em células HRT-18, e a caracterização molecular de estirpes brasileiras do BCoV. Três amostras de fezes diarreicas de bezerros com 30 dias de idade foram inoculadas em culturas de células HRT-18. Os isolados foram avaliados por hemaglutinação (HA) e por uma semi-nested PCR seguida de RFLP e sequenciamento. Duas amostras foram isoladas e a confirmação foi verificada na semi-nested PCR e também RFLP. Na HA os títulos foram de 16 e 32 unidades por 25 mL. Análises moleculares identificam a estirpe adaptada em cultura celular e uma estirpe selvagem, como estirpes de BCoV semelhantes (99 por cento) entre si, mas distintas das circulantes em outros países, mesmo em um gene de uma proteína conservada (gene N).

An outbreak of winter dysentery caused by bovine coronavirus in a high-production dairy cattle herd from a tropical country

Bovine coronavirus (BCoV) is a known cause of winter dysentery (WD) in adult cattle. The morbidity of the disease is high, that results in a significant decrease in milk production and consequently, economic losses. In the present study, we report on a classical outbreak of WD that affected a high-production Holstein dairy herd raised in a tropical country. The lactating batch included 154 cows, and 138 (90 percent) presented diarrhea in a short (nine days) period of time. Three (2 percent) cows died. The other batches of animals did not become ill. The evolution of the disease in the herd, including the clinical signs and epidemiological features, strongly suggested a WD case. Semi-nested PCR and RFLP confirmed that BCoV was the cause of the infection. Samples tested negative for all other enteric pathogens. This case report highlights the importance of BCoV in WD even in tropical countries such as Brazil.

O coronavirus bovino (BCoV) pode causar a diarreia de inverno (WD - Winter Dysentery) ao infectar bovinos adultos, particularmente em regiões de clima temperado ou frio. A morbidade da doença é alta, resultando em queda na produção de leite e, consequentemente, perdas econômicas. No presente estudo, é descrito um surto clássico de WD acometendo um rebanho de bovinos leiteiros da raça Holandesa PB, de alta produção, proveniente do estado do Paraná. O lote afetado era composto por 154 vacas em lactação, sendo que 138 (90 por cento) apresentaram diarreia em um curto (nove dias) período de tempo e 3 (2 por cento) vacas morreram em consequência da diarreia, desidratação e desequilíbrio eletrolítico. As outras categorias de animais do rebanho (bezerras, novilhas e vacas secas) não apresentaram sinal clínico. A evolução da doença clínica, assim como a epidemiologia da infecção sugeriu um quadro clássico de WD. O diagnóstico foi realizado por meio da identificação do BCoV, pela técnica de semi-nested PCR e confirmação por RFLP, em amostra fecal de uma vaca que veio a óbito. A presença de outros patógenos entéricos também foi avaliada e apresentou resultados negativos. O surto de WD descrito na região sul do Brasil alerta para a possibilidade da ocorrência dessa virose também em países situados em regiões de clima tropical.

Frequency of group a rotavirus in piglet stool samples from non-vaccinated Brazilian pig herds

Neonatal diarrhea is one of the main causes of morbidity and mortality in piglets, and it leads to significant economic losses for pig farmers worldwide. The aim of this study was to determine the frequency of diagnosis, age group, and association of group A rotavirus (GARV) infection with diarrhea in piglets from pig herds in two (south and center-west)Brazilian geographical regions. The frequency of GARV diagnosis was evaluated between 2004 and 2007, using SS-PAGE on 681 fecal samples (428 diarrheic and 253 with normal consistency) from 1-4 week-old piglets. The animals were selected from 130 pig herds and 80 counties in the states of Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, Mato Grosso do Sul, and Mato Grosso, Brazil. None of the herds were vaccinated against porcine GARV. Rotaviruses with the typical GARV electrophoretic pattern was identified in 193 (28.3 percent) fecal samples, and of these, 157 (81.3 percent) were diarrheic (p=0.001).Porcine GARV infection was identified in animals from all age groups evaluated, and the highest infection rate (54.7 percent; p=0.001) occurred in diarrheic piglets between 21 and 28 days of age. Diarrheic feces from 1-7 day-old piglets also had a high rate of rotavirus presence (32.3 percent), suggesting a failure in passive immunity. The high rate of porcine GARV infection in all geographical regions studied demonstrates the involvement of rotavirus in the etiology of neonatal diarrhea in Brazilian pig herds. This study highlights the importance of GARV infection for pig raising and the need of control and prophylactic measures for porcine rotavirus infection, including vaccination in the main areas of pork production in Brazil.

A diarréia neonatal é uma das principais causas de morbidade e mortalidade em leitões, ocasionando consideráveis prejuízos econômicos à suinocultura em todo o mundo. O objetivo desse estudo foi determinar a frequência de diagnóstico, distribuição etária e a associação com diarreia da infecção por rotavírus grupo A (GARV) em leitões de granjas situadas em duas (sul e centro-oeste) regiões geográficas brasileiras. A frequência de diagnóstico do GARV foi avaliada no período de 2004 a 2007, pela técnica de SS-PAGE, em 681 amostras fecais (428 diarréicas e 253 com consistência normal) de leitões de 1 a 4 semanas de idade. Os animais eram provenientes de 130 granjas, localizadas em 80 municípios dos estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, Mato Grosso do Sul e Mato Grosso. Nenhum dos rebanhos realizava vacinação contra o GARV suíno. Rotavírus suíno com perfil eletroforético característico do grupo A foi detectado em 193 (28,3 por cento) amostras, das quais 157 (81,3 por cento) diarreicas (p=0,001). A infecção foi identificada em animais de todas as faixas etárias avaliadas e a maior frequência (54,7 por cento; p=0,001) de diagnóstico ocorreu em leitões diarréicos com 21 a 28 dias de idade. A alta taxa (32,3 por cento) de diagnóstico do rotavírus em fezes diarreicas de leitões com 1 a 7 dias de vida sugere a necessidade da adoção de condutas que objetivem o incremento da imunidade passiva. A frequência de diagnóstico e a ampla distribuição das infecções pelo GARV, nos rebanhos das regiões geográficas avaliadas nesse estudo, ratificam a importância da rotavirose na etiologia dos episódios de diarreia de leitões no Brasil. Este resultado destaca também a importância do controle e medidas profiláticas na infecção por rotavírus suíno, incluindo a vacinação nas principais áreas de produção suína no Brasil.

Neurological and epidemiological aspects of a BoHV-5 meningoencephalitis outbreak

Bovine herpesvirus 5 is a DNA virus that has been associated with meningoencephalitis in young cattle. While its clinical diagnosis is obscured by other major diseases that also produce similar neurological disease in cattle, the use of conventional virological techniques is hampered by the establishment of a lifelong latent infection in the host and the difficulty in differentiating BoHV-1 and BoHV-5. The aim of the current report is to describe the clinical and epidemiological aspects observed in a natural outbreak of BoHV-5 meningoencephalitis in a dairy cattle herd from Brazil. In the outbreak, the affected animals consisted of nine calves, which presented three possible forms of the neurological disease, subjectively classified as peracute, acute, and subacute/chronic. In contrast to conventional herpetic meningoencephalitis, characterized mainly by progressive multifocal brain dysfunctions, BoHV-5 infection resulted in focal non-progressive caudal brainstem dysfunction (pontomedullary syndrome) in an animal presented with subacute/chronic BoHV-5 meningoencephalitis. The evaluation of CNS tissue of affected calves through both histological examination and multiplex-PCR was able to confirm BoHV-5 infection. Additionally, the analysis of CSF samples through PCR allowed ante-mortem BoHV-5 diagnosis during the outbreak, which enabled the implementation of several measures of control for the disease.

O herpesvírus bovino 5 é um vírus DNA que tem sido associado a casos de meningoencefalite em bovinos jovens. Enquanto o diagnóstico clínico da doença é dificultado pelo fato de outras enfermidades importantes também determinarem quadro neurológico em bovinos, a utilização de técnicas virológicas convencionais no diagnóstico laboratorial tem sido inviabilizada pela latência viral que ocorre no hospedeiro e pela dificuldade em se diferenciar o BoHV-1 do BoHV-5. O objetivo deste relato é o de descrever alguns aspectos clínicos e epidemiológicos observados em um surto de meningoencefalite determinado pelo BoHV-5 em um rebanho bovino leiteiro do estado do Paraná, Brasil. Neste surto, nove bezerros afetados apresentaram três formas distintas da doença, subjetivamente classificadas como hiperaguda, aguda e subaguda/crônica. Diferentemente da meningoencefalite herpética convencional, caracterizada principalmente por disfunções cerebrais multifocais progressivas, a infecção pelo BoHV-5 resultou em disfunção focal não-progressiva do tronco encefálico (síndrome pontobulbar) em um animal apresentando a meningoencefalite subaguda/crônica por BoHV-5. As avaliações de tecido do sistema nervoso de bezerros afetados, por meio do exame histológico e da técnica de multiplex-PCR, confirmaram a infecção pelo BoHV-5. Adicionalmente, a análise de amostras de líquor por meio da PCR permitiu o diagnóstico ante-mortem da infecção pelo BoHV-5, fato que possibilitou a implementação de várias medidas de controle para a doença durante o surto.

A bovine teat papilloma specimen harboring Deltapapillomavirus (BPV-1) and Xipapillomavirus (BPV-6) representatives

The common occurrence of multiple papillomavirus infections has been shown in several studies involving the human host. However, investigations with the aim of identifying mixed papillomavirus infections in cattle have been conducted only recently. In the current work we describe a co-infection with two different bovine papillomavirus (BPV) types that was identified in a bovine teat papilloma. The skin wart was obtained from a cow belonging to a Brazilian beef herd. A PCR assay was carried out with the FAP primer pair, which amplifies a partial segment of the L1 gene (approximately 478 bp), and the amplicon was submitted to direct sequencing. Because nucleotide sequences with satisfactory quality scores were not obtained, the amplicon was cloned and further sequencing, involving ten selected clones, was performed. The sequence analysis of the cloned inserts revealed the presence of two different BPV types. BPV-1 (Deltapapillomavirus genus) was detected in six clones, while BPV-6 (Xipapillomavirus genus) was detected in four clones. This finding confirms the presence of BPV co-infection associated with cutaneous papillomatosis in cattle.

Em seres humanos, as infecções múltiplas pelo papilomavírus têm sido demonstradas em vários estudos. Em bovinos, somente recentemente foram conduzidas investigações com o objetivo de avaliar infecções mistas pelo papilomavírus. O presente trabalho teve como objetivo descrever a co-infecção por dois tipos de papilomavírus bovino (BPV) em um papiloma de teto. A amostra clínica foi obtida de uma vaca pertencente a um rebanho de corte localizado na região norte do estado do Paraná, Brasil. Inicialmente, a técnica de PCR foi realizada com o par de oligonucleotídeos iniciadores FAP, que amplificam um segmento do gene L1, sendo que o amplicon gerado foi submetido ao sequenciamento direto. Entretanto, como as sequências obtidas não apresentaram qualidade aceitável, o amplicon foi clonado e dez clones foram selecionados para um novo sequenciamento. A análise das sequências dos insertos revelou a presença de dois diferentes tipos de BPV. O BPV-1 (gênero Deltapapillomavirus) foi detectado em seis clones, enquanto o BPV-6 (gênero Xipapillomavirus) foi detectado em quatro clones. Esse resultado confirma a ocorrência da co-infecção pelo BPV associada a papilomas cutâneos em bovinos.

Multiple bovine papillomavirus infections associated with cutaneous papillomatosis in brazilian cattle herds

Cutaneous papillomatosis is a pathological condition commonly found in cattle and is characterized by the presence of benign proliferative tumors caused by bovine papillomavirus (BPV) infection. While multiple infections with human papillomavirus (HPV) are common in healthy and immunodeficient humans, studies with the aim of identifying mixed infections are still sporadic in veterinary medicine. The aim of this study is to describe the occurrence of multiple BPV infections in cattle affected by cutaneous papillomatosis. Fifteen skin warts were collected from at least two diverse anatomical regions of six bovines with papillomatosis belonging to three cattle herds from the Paraná state in Brazil. The BPV types present in the skin wart samples were determined by a PCR assay performed with the FAP primer pair for partial L1 gene amplification followed by direct sequencing or by cloning and sequencing of the inserts. Sequence analysis of the obtained amplicons allowed the identification of four characterized BPV types (BPV-1, -2, -6, and -8) and three previously described putative new BPV types (BPV/BR-UEL3, BPV/BR-UEL4, and BPV/BR-UEL5). Double infections were identified in four (A, B, D, and E) of the six animals included in this study. In this work, the strategy adopted to evaluate skin warts from diverse anatomical sites of the same animal allowed the identification of multiple infections with two or three different BPV types. The analysis of four animals belonging to a single cattle herd also showed the presence of six different viral types. These results clearly suggest that both multiple papillomaviral infection and a high viral diversity can be as frequent in cattle as in human beings.

A papilomatose cutânea é comumente observada nos rebanhos bovinos e caracterizada pela presença de tumores proliferativos benignos causados pela infecção pelo papilomavírus bovino (BPV). Enquanto a infecção múltipla pelo papilomavírus humano (HPV) é um achado comum tanto em seres humanos saudáveis quanto em pacientes com imunodeficiência, na medicina veterinária esses relatos ainda são escassos. O objetivo desse estudo foi descrever a ocorrência de infecções múltiplas pelo BPV em rebanhos afetados pela papilomatose cutânea. Quinze papilomas foram obtidos, de pelo menos duas regiões anatômicas diferentes, de seis bovinos com papilomatose e provenientes de três rebanhos de corte localizados no estado do Paraná, Brasil. Os tipos virais presentes nas lesões foram identificados por PCR, utilizando o par de oligonucleotídeos iniciadores FAP, seguidos de sequenciamento direto ou clonagem e novo sequenciamento dos insertos. A análise das sequências obtidas permitiu a identificação do BPV-1, -2, -6 e -8, além de supostos novos tipos (BPV/BR-UEL3, BPV/BR-UEL4, e BPV/BR-UEL5), descritos anteriormente. Infecções por dois tipos diferentes de BPV foram identificadas em quatro animais (A, B, D e E) dos seis incluídos nesse estudo. A estratégia adotada neste estudo permitiu a identificação de infecção múltipla por dois ou três diferentes tipos virais do BPV no mesmo animal. Além disso, a avaliação de quatro animais de um mesmo rebanho demonstrou a presença de seis tipos virais circulantes. Esses resultados sugerem que tanto as infecções múltiplas quanto a grande diversidade viral podem ser frequentes nos bovinos, assim como o observado nos humanos. O reconhecimento da multiplicidade e complexidade das infecções pelo BPV pode colaborar para o entendimento dos aspectos epidemiológicos, clínicos e imunológicos da papilomatose cutânea nos rebanhos bovinos.

Molecular epidemiology of the human group A rotavirus in the Paraná State, Brazil

From January/2000 to December/2003, 550 diarrheic fecal samples from the children and adults were collected in several geographical regions of Paraná State, Brazil. The enzyme immunoassay showed 120 (21.8 percent) samples positive for the group A rotaviruses. One hundred and fourteen samples were genotyped by multiplex-nested-PCR assay. The highest frequency (77.5 percent) of the positive samples (n=93) was observed in the children under 5 years old. Rotavirus diarrhea was more frequent in the cold and dry seasons of the four evaluated years. The most frequent genotypes were: G1 (50.9 percent), G4 (9.6 percent), G9 (7.0 percent), G2 (1.7 percent), G3 (0.9 percent), P[ 8] (71.9 percent), and P[ 4] (3.5 percent). The P[ 8] G1 (46.5 percent) and P[ 8] G4 (9.6 percent) were the main combinations found to P and G genotypes. The mixed infections, characterized by the rotaviruses with more than one genotype G or P, and nontypeable rotavirus were observed in 8.8, 3.5, and 16.7 percent of the samples, respectively. The identification of the G9 genotype in the rotavirus strains tested along the four years of studies ratifies the emergency of this genotype also in Paraná State, South region of Brazil, as the worldwide.

No período de janeiro de 2000 a dezembro de 2003 foram colhidas, em várias regiões geográficas do Estado do Paraná, 550 amostras fecais de crianças e adultos com quadro clínico de diarréia aguda. Por meio de ensaio imunoenzimático comercial, 120 (21,8 por cento) amostras foram positivas para o rotavírus grupo A. Dessas, 114 amostras foram genotipadas por meio da multiplex-nested-PCR. A maior freqüência (77,5 por cento) de amostras positivas (n=93) foi observada em crianças menores de cinco anos de idade. A maior concentração de casos positivos para o rotavírus ocorreu nos meses frios e secos dos quatro anos avaliados. Os genotipos de maior ocorrência foram: G1 (50,9 por cento), G4 (9,6 por cento), G9 (7,0 por cento), G2 (1,7 por cento), G3 (0,9 por cento), P[ 8] (71,9 por cento) e P[ 4] (3,5 por cento). P[ 8] G1 (46,5 por cento) e P[ 8] G4 (9,6 por cento) foram as associações de genotipos P e G mais encontradas. Infecções mistas, caracterizadas por estirpes de rotavírus com mais de um genotipo G, P e amostras não-genotipadas foram observadas, respectivamente, em 8,8, 3,5 e em 16,7 por cento das amostras. De forma semelhante ao que vem ocorrendo em várias partes do mundo a identificação do genotipo G9 em estirpes de rotavírus identificadas ao longo dos quatro anos do estudo ratifica a emergência desse genotipo também no Estado do Paraná, Brasil.

Identification of a mutation in the spike protein cleavage site in Brazilian strains of wild-type bovine coronavirus

The spike (S) protein of coronaviruses, a type I membrane glycoprotein, is primarily responsible for entry into susceptible cells by binding with specific receptors on cells and mediating subsequent virus-cell fusion. The bovine coronavirus (BCoV) S protein is cleaved into two subunits, the N-terminal S1 and the C-terminal S2. The proteolytic cleavage site of S protein is highly conserved among BCoV strains and is located between amino acids 763 and 768 (KRRSRR). This study describes a single mutation in the S protein cleavage site of three Brazilian strains of BCoV detected in diarrheic fecal samples from calves naturally infected. The sequenced PCR products revealed that amino acid sequence of the cleavage site of our strains was KRRSSR, indicating a mutation at amino acid position 767 (R ® S). This amino acid substitution occurred due to a single nucleotide substitution in the sequence of DNA corresponding to the proteolytic cleavage site, CGT to AGT. This is the first description of this nucleotide mutation (C to A), which resulted in the substitution of arginine to serine in the S cleavage site. In this study we speculated the probable effects of this mutation in the proteolytic cleavage site using the murine hepatitis coronavirus (MHV) as a comparative model.

A proteína da espícula (S), uma glicoproteína de membrana do tipo I, é primariamente responsável pela entrada do vírus em células susceptíveis por meio da interação inicial com receptores celulares específicos e subseqüente mediação da fusão vírus-célula. A proteína S do coronavírus bovino (BCoV) é clivada em duas subunidades: a S1, na região N-terminal e a S2, na região C-terminal. O sítio de clivagem proteolítica da proteína S é altamente conservado entre as estirpes de BCoV e está situado entre os aminoácidos 763-768 (KRRSRR). Este estudo descreve uma mutação no sítio de clivagem da proteína S de três estirpes do BCoV detectadas em amostras fecais diarréicas de bezerros naturalmente infectados no Brasil. O seqüenciamento dos produtos de PCR identificou a seqüência de aminoácidos KRRSSR no sítio de clivagem de nossas amostras, indicando uma mutação na posição 767 (R->S). Esta mutação ocorreu devido a uma única substituição de nucleotídeo no sítio de clivagem proteolítica, alterando o códon CGT para AGT. Esta é a primeira descrição desta mutação de nucleotídeo (C para A), que resultou na substituição do aminoácido arginina por serina no sítio de clivagem da proteína S. Neste estudo também são sugeridos os prováveis efeitos desta mutação no sitio de clivagem proteolítica utilizando o coronavírus da hepatite dos camundongos (MHV) como um modelo comparativo.

Bovine herpesvirus 5 detection by virus isolation in cell culture and multiplex-PCR in central nervous system from cattle with neurological disease in Brazilian herds

Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) is an important cause of meningoencephalitis in young and adult cattle. The multiple etiology of neurological disturbances in cattle makes the quick and conclusive diagnosis of BoHV-5 infection important for animal and public health, mainly because of herbivore rabies that is endemic in Brazilian cattle herds. The objective of this retrospective study was to use a multiplex-polymerase chain reaction (multiplex-PCR) for BoHV-5 and BoHV-1 glycoprotein C gene detection from stored central nervous system (CNS) tissue fragments of cattle with neurological clinical signs. Forty-seven frozen CNS samples of young and adult cattle from 31 herds in three Brazilian geographical regions (South, Southeast, and Center-west) were evaluated. Eighteen (38.3 percent) of these CNS samples were BoHV-positive by virus isolation in cell culture. By multiplex-PCR 30 (63.8 percent) CNS samples were BoHV-5 positive. All 18 positive samples by virus isolation were confirmed as BoHV-5 by the multiplex-PCR, that provided a increase of 25.5 percent (12/47) in the BoHV-5 diagnosis rate. BoHV-1 was not detected in any CNS sample. This retrospective study demonstrated the wide regional distribution of BoHV-5 infection in Brazilian cattle herds since positive results were obtained in CNS samples of cattle with neurological disease from Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso, and Mato Grosso do Sul States.

O herpesvírus bovino 5 (BoHV-5) é um importante agente etiológico de meningoencefalite em bovinos jovens e adultos. A etiologia múltipla dos distúrbios neurológicos em bovinos torna o diagnóstico conclusivo do BoHV-5 importante tanto em termos de sanidade animal quanto de saúde pública, principalmente pela característica endêmica da raiva dos herbívoros nos rebanhos bovinos brasileiros. O objetivo desse estudo retrospectivo foi utilizar a reação em cadeia da polimerase (multiplex-PCR) para a detecção do gene da glicoproteína C do BoHV-5 e do BoHV-1 em fragmentos estocados de sistema nervoso central (SNC) de bovinos com sinais clínicos neurológicos. Foram avaliadas 47 amostras congeladas de fragmentos de SNC de bovinos jovens e adultos pertencentes a 31 rebanhos de três regiões geográficas brasileiras (Sul, Sudeste e Centro-oeste). Por meio do isolamento viral em cultivo celular foi possível o isolamento do BoHV em 18 (38,3 por cento) amostras. Pela técnica de multiplex-PCR 30 (63,8 por cento) amostras de SNC foram positivas para o BoHV-5. Todas as 18 amostras positivas no isolamento viral foram confirmadas como BoHV-5 pela multiplex-PCR, proporcionando um incremento na taxa de diagnóstico do BoHV-5 de 25,5 por cento (12/47). Em nenhuma das amostras avaliadas foi possível a identificação do BoHV-1 pela multiplex-PCR. Esse estudo retrospectivo demonstrou a ampla distribuição da infecção pelo BoHV-5 nos rebanhos bovinos brasileiros uma vez que resultados positivos foram obtidos em amostras de SNC colhidas de bovinos com doença neurológica, provenientes dos estados do Paraná, São Paulo, Minas Gerais, Mato Grosso e Mato Grosso do Sul.

Virus isolation and molecular characterization of canine distemper virus by RT-PCR from a mature dog with multifocal encephalomyelit

A case of multifocal distemper encephalomyelitis in a mature dog is described. In the presented case the ante mortem clinical diagnosis of canine distemper virus (CDV) infection could not be ideally performed due to the absence of typical signs of distemper, such as myoclonus and systemic signs accompanying the nervous signs. The definitive diagnosis of distemper encephalomyelitis was only carried out at post mortem through virus isolation in cell culture from fresh central nervous system (CNS) fragments and CDV nucleoprotein gene detection in the CNS by RT-PCR.

Descreve-se um caso de encefalomielite multifocal pela cinomose em um cão adulto. No caso apresentado o diagnóstico clínico da infecção pelo vírus da cinomose canina (CDV) não pode ser adequadamente realizado devido à ausência de sinais típicos da enfermidade, tais como mioclonia e sinais sistêmicos. O diagnóstico definitivo somente foi possível post mortem pelo isolamento do CDV em cultivo celular a partir dos fragmentos frescos do sistema nervoso central (SNC) e pela detecção do gene da nucleoproteína do CDV em fragmentos do SNC por meio da RT-PCR.

Avaliação do efeito da suplementação terapêutica com probiótico em cães filhotes com gastrenterite hemorrágica / Evaluation of the therapeutic supplementation with commercial powder probiótic to puppies with hemorrhagic gastroenteritis

A gastrenterite hemorrágica (GHE) é uma afecção comum em filhotes de cães, e motivo freqüente de internação e mortalidade. Considerando que probióticos têm sido apontados como benéficos no tratamento destes pacientes, avaliamos o impacto da inclusão de probiótico á base de Lactobacillus acidophillus em 100 filhotes de cães com GHE, distribuídos em dois grupos de 50 indivíduos. Os cães do grupo 1 (G1), além da terapia indicada para GEH, constituída de fluido e antibiótico terapia e antiemético, receberam, por via oral, probiótico. Para os animais do grupo 2 (G2) foi adotada apenas a terapêutica convencional. Foram quantificadas as partículas virais nas fezes, pela hemaglutinação (HA) e os anticorpos (Ac) anti-parvovírus por inibição da hemaglutinação. Foram registradas a duração da internação e a tolerância dos animais ao probiótico. A excreção viral nas fezes pelos animais de ambos os grupos foi semelhante no momento da internação (P=0,746) e da alta hospitalar (P=0,294). Entretanto, no G1 a excreção foi significativamente menor no momento da alta (p<0,001). O período de internamento variou de um a 15 dias no G1 e de um a 10 dias no G2 (P=0,70). A taxa de mortalidade no G1 foi de 37,50 (18/48) e de 26 (13/50) no G2 (P=0,49). A aceitação do probiótico variou de regular a ótima em 95 das administrações, porém, os animais que foram a óbito demonstraram intolerância. Com estas observações não foi estabelecida relação entre a administração de probiótico e recuperação da doença, abreviação do período de internação ou ao aumento da resposta humoral. Porém, a suplementação reduziu a excreção fecal de vírus, o que é benéfico quando se considera a menor disseminação do vírus no ambiente

Hemorrhagic gastroenteritis (GHE) is a common motivation to hospitalization and mortality betweenpuppies. Considering the beneficial effects of probiotics in the treatment of some gastrointestinal disorders,we evaluated the usefulness of the probiotic product in 100 puppies hospitalized because GHE. Fifthdogs were treated by intravenous fluid, antiemetic, antibiotics and probiotic product (G1), and the other50 only by supportive and symptomatic therapy (G2). We accessed the titters of anticorpus anti-parvovirusby HI, fecal excretion of virus by HA and registered the duration of internation period and tolerance toprobiotic ingestion. The titters of HI were similar between G1 and G2 in the samples from entrance (P =0,553) and at the hospital discharge (P = 0,844), moreover arises during hospitalization in booth groups(P < 0,001). The fecal excretion of virus of G1 and G2 were similar in booth moments (P = 0,746 and P =0,294, respectively) furthermore the G1 showed lowest fecal titters of virus at hospital discharge (P <0,001). The internation period in the G1 variates one to 15 days and one to 10 days in the G2 group,without statistical difference between the groups (P = 0,70). The rate of mortality in the G1 was 37,50%(18/48) and 26% (13/50) in the G2, lacking statistical significance (P = 0,49). Probiotic tolerance wasregular to excellent in 95% of the administrations, furthermore the animals that died demonstrate intolerance.These observation permits no established a relationship between the administration of Lactobacilusacidophillus based probiotic and shortening treatment duration, improved in the disease evolution oranticorpus production, likewise showed positive influence over fecal excretion of virus. Considering theparvovirosis, this is a desirable factor to decrease dissemination of the disease between susceptiblepopulation

Avaliação da capacidade adjuvante do cloreto de dimetildioctadecilamônio associado ao hidróxido de alumínio na indução da resposta imune humoral de bovinos vacinados com o vírus da diarréia viral bovina / Evaluation of the adjuvant activity of dimethyl dioctadecyl ammonium chloride associated with the ammonium hydroxide to induction of humoral immune response of cattle vaccinated with bovine viral diarrhea virus

A resposta imunológica humoral de bovinos vacinados com o vírus da diarréia viral bovina (BVDV) inativado, tendo como adjuvante o cloreto de dimetildioctadecilamônio (DDA cloreto) associado ao hidróxido de alumínio (vacina B), foi comparada com uma vacina contendo o mesmo antígeno adsorvido apenas com hidróxido de alumínio (vacina A). Duas semanas após a segunda dose foi avaliado o título de anticorpos neutralizantes dos animais que receberam as duas preparações de antígenos. Os animais que receberam a vacina B apresentaram melhor resposta imune humoral quando comparados com os animais vacinados com a vacina A. O título médio de anticorpos neutralizantes, expresso em Log2, dos animais que receberam a vacina B foi superior (P<0,05) ao observado no grupo vacinado com a vacina A. Esse resultado demonstra que, em bovinos vacinados com o BVDV inativado, a inclusão do DDA cloreto em formulações de vacinas adsorvidas com hidróxido de alumínio potencializa a resposta imune humoral.

Segmented double-stranded genomic RNA viruses in fecal samples from broiler chicken

A técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida foi utilizada com o objetivo de identificar vírus com genoma contituído por RNA de fita dupla (dsRNA) segmentado, em material fecal de frangos de corte. Foram analisadas 378 amostras de fezes de aves, com idade entre a primeira e sétima semanas de vida, provenientes de granjas avícolas localizadas no Estado do Paraná, Brasil. dsRNA com perfil de migracão característico de rotavírus (AvRV), reovírus (ARV) ou picobirnavírus (PBV), foi identificado em 32 (8,5 per center), 7 (1,8 per center) e 13 (3,4 per center) amostras, respectivamente. AvRV e ARV ocorreram com maior freqüência em aves com até um mês de idade e estiveram diretamente relacionados a fezes diarréicas e pastosas, provenientes de aves com sinais clínicos de enterite. Considerando-se apenas as amostras de fezes colhidas em aves com diarréia, o AvRV foi detectado em 37,8 per center (14/37) e o ARV em 13,5 per center (5/37) da amostragem analisada. Em fezes com aspectos normais (controle) obtidas de aves clinicamente sadias, o AvRV foi identificado em apenas 1,5 per center (4/274) e o ARV não foi detectado. O ácido nucléico do PBV foi detectado com maior freqüência em fezes pastosas colhidas de aves com duas a sete semanas de vida. O AvRV apresentou grande variabilidade eletroforética dos segmentos de dsRNA, tendo sido identificados nove eletroferotipos distintos. Não foram observadas variacões no perfil genômico nas amostras de ARV e também de PBV.

Influência da idade e do tamanho do rebanho na soroprevalência da Leucose Enzoótica Bovina em rebanhos produtores de leite tipo B, na região norte do estado do Paraná / Herd size and age influences at Enzootic Bovine Leukosis serum prevalence in dairy herds (Type B milk) in north of Paraná state

A soroprevalência da Leucose Enzoótica Bovina (LEB), em fêmeas com idade superior a 15 meses provenientes de rebanhos produtores de leite do tipo B, na região norte do estado do Paraná foi determinada pela técnica de imunodifusão em ágar-gel. Foram avaliados 624 soros sangüíneos de animais pertencentes a 23 rebanhos de oito municípios. Identificaram-se 254 (40,7"10) animais soropositivos, distribuídos em todos os 23 (100"10) rebanhos avaliados. Animais com idade superior a dois anos tiveram risco de infecção 2,7 vezes maior (1,6 < aR < 4,5) quando comparados aos animais com idade inferior. A prevalência da infecção foi estatisticamente superior (p = 0,043) em rebanhos com menos de 100 animais. Estes resultados demonstram que a LEB está disseminada nos rebanhos produtores de leite tipo B, incluídos neste estudo

Comparaçäo das técnicas de ELISA indireto e de soroneutralizaçäo na detecçäo de anticorpos contra o BHV-1 em amostras de soro bubalino (Bubalus bubalis) / Comparison of a commercial enzyme immune assay (ELISA) and serum neutralization techniques for the detection of antibodies against BHV-1 in buffaloes (Bubalus bubalis) sera

O desempenho de um ELISA comercial (Bovine Rhinotracheitis virus antibody test Kit, Herdcheck®, IDEXX Laboratories Inc., USA) para a identificaçäo de anticorpos anti-herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1), em soro bovino, foi avaliado em 133 amostras de soro de búfalos (Bubalus bubalis), sem histórico de vacinaçäo para IBR, da Regiäo do Vale do Ribeira, Estado de Säo Paulo. Tomando-se a técnica de soroneutralizaçäo como referência, o ELISA indireto apresentou sensibilidade e especificidade relativa de 97,14 e 46,03 por cento, respectivamente. A concordância estimada pelo índice kappa, entre os dois métodos, foi de 0,44 IC (0,29-0,59), utilizando um intervalo de confiança de 95 por cento

Ensaio imunoenzimático comercial no diagnóstico sorológico das infecçöes por herpesvírus bovino 1 / A commercial enzyme immune assay in serodiagnosis of bovine herpesvirus 1 infections

Avaliou-se o desempenho de um ensaio imunoenzimático, obtido de fonte comercial, na identificaçäo de anticorpos contra herpesvírus bovino tipo 1 (BHV-1), induzidos tanto por infecçäo natural quanto por vacinaçäo, em 1000 amostras de soros sanguíneos de bovinos. A análise comparativa dos resultados obtidos no sistema avaliado e na técnica padräo de soroneutralizaçäo mostrou uma concordância de 97,05 por cento (K=0,94) entre as duas metodologias de diagnóstico sorológico.

Prevalência de anticorpos neutralizantes contra o herpesvírus bovino tipo 1, decorrente de infecçäo natural, em rebanhos com distúrbios reprodutivos / Prevalence of neutralizing antibodies against bovine herpesvirus type 1, due natural infection, in herds with reproductive problems

A detecçäo de anticorpos anti-Herpesvírus Bovino tipo 1 (BHV-1) foi realizada, através da técnica de soroneutralizaçäo, em 1235 amostras de soro de bovinos adultos, näo vacinados contra Rinotraqueíte Infecciosa Bovina. As amostras de soro analisadas foram colhidas em 81 rebanhos, com histórico de problemas reprodutivos, incluindo animais com aptidäo para carne e leite, provenientes de 30 municípios do Estado do Paraná. Na amostragem proveniente de rebanhos leiteiros, 41,9 por cento (409/977) das amostras de soro e 90,5 por cento (57/63) dos rebanhos foram considerados positivos. Em bovinos de corte, o índice de soropositividade foi de 50,8 por cento (131/258) e 100 por cento (18/18) para amostras de soro e rebanhos, respectivamente. As frequências de 43,7 por cento (540/1235) de animais e 92,6 por cento (75/81) de rebanhos soropositivos demonstram que as infecçöes por BHV-1 apresentam-se amplamente disseminadas nas regiöes estudadas.